Fonte: SpringerOpen - 11.08.2020
Contro il principio di precauzione, contro la normativa italiana e quella europea, le Commissioni Agricoltura e Ambiente del Senato hanno recentemente approvato all’unanimità (30 maggio 2023) un emendamento al Decreto Siccità che apre alla sperimentazione in campo dei nuovi OGM.
Forse anche sulla scorta del fatto che la SIGA (Società Italiana di Genetica Agraria) «è uno dei principali sostenitori di un approccio biotecnologico alla soluzione dei problemi in agricoltura». La Coalizione Italia Libera da Ogm ha chiesto, attraverso una diffida inviata ai parlamentari italiani e agli organismi europei, l'immediato ritiro di questo emendamento, che rappresenta la premessa per portare sulle nostre tavole cibo geneticamente modificato.
La questione, come si capisce, è serissima. Da anni le multinazionali americane fanno pressioni perché l'Italia apra le porte agli Ogm e oggi si stanno creando le condizioni perché ciò avvenga.
Come attesta un'ampia letteratura, anche gli Ogm di nuova generazione (NET: New Editing Techniques), che si vuole far passare per “naturali”, non essendo transgenici, sono ancora una grande incognita per la salute. L’ingegneria genetica applicata all’agricoltura, col suo approccio riduzionista, perde inoltre di vista le acquisizioni più recenti della nuova biologia epigenetica che, una volta per tutte, «ha demistificato il mito del DNA che governa da monarca assoluto il destino di ogni essere, mettendo in luce l’intricata ecologia delle influenze DNA/cellula/corpo/mente/ambiente esterno. L’ambiente è il grande pianista del DNA» (Daniela Conti)
Estendere la valutazione del rischio degli OGM nell'UE alle tecnologie di editing genomico per l’agricoltura
Abstract
Le tecniche di editing genomico, in particolare la tecnologia CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) [trad. brevi ripetizioni palindrome raggruppate e separate a intervalli regolari], aumentano le possibilità e la velocità di alterazione del materiale genetico negli organismi. Il cosiddetto editing genomico viene utilizzato sempre più spesso per ottenere nuovi tratti e/o combinazioni genetiche rilevanti dal punto di vista agricolo sia nelle piante che negli animali, anche se prevalentemente come test di prova, con coltivazioni o allevamenti commerciali finora limitati agli Stati Uniti e al Canada. Tuttavia, esistono numerose segnalazioni di effetti indesiderati, come effetti fuori bersaglio, effetti indesiderati su bersaglio e altre conseguenze indesiderate derivanti dall'editing genomico, riassunte sotto il termine di irregolarità genomiche. Ciononostante, la ricerca di irregolarità genomiche è tutt'altro che di routine in questi studi e i protocolli variano notevolmente, in particolare per quanto riguarda gli effetti fuori bersaglio, con conseguenti differenze nell'efficacia del rilevamento degli effetti fuori bersaglio. Qui descriviamo la gamma di specifici effetti indesiderati associati all'editing genomico. Esaminiamo le notevoli possibilità di modificare il genoma di piante e animali con l'editing genomico SDN-1 e SDN-2 (cioè senza l'inserimento di geni che conferiscono una nuova caratteristica) e dimostriamo che le tecniche di editing genomico sono in grado di produrre un ampio spettro di nuovi tratti che, finora, non era possibile ottenere con le tecniche di riproduzione convenzionali. Riteniamo che le attuali linee guida dell'UE per la valutazione del rischio degli OGM debbano essere riviste ed estese per cogliere tutte le potenziali irregolarità genomiche derivanti dall'editing genomico e suggeriamo ulteriori strumenti per aiutare la valutazione del rischio di piante e animali geneticamente modificati per l'ambiente e gli alimenti/mangimi nell'UE.
Premessa
Gli organismi geneticamente modificati (OGM), soprattutto piante, sono coltivati commercialmente in alcuni paesi, in particolare nelle Americhe, dalla metà degli anni Novanta [1]. Quasi tutti gli OGM attualmente in commercio sono stati sviluppati utilizzando quella che qui viene definita tecnologia di ingegneria genetica di “prima generazione”. In altre parole, questi OGM contengono DNA ricombinante in cui una sequenza di DNA contenente uno o più geni funzionali, relativi a una nuova caratteristica, viene inserita a caso nel genoma dell'organismo ricevente [2]. Ne sono un esempio la soia GM tollerante agli erbicidi “Roundup Ready” e il mais Bt resistente agli insetti [1]. Nell'ultimo decennio sono state sviluppate applicazioni per l'agricoltura di nuove tecnologie di ingegneria genetica di seconda generazione, in particolare le cosiddette tecnologie di editing genomico [3, 4]. Esiste una controversia sulla terminologia utilizzata per descrivere queste tecniche. L'editing genomico viene spesso definito “editing genico”, ma non include le alterazioni di più geni o di elementi genomici regolatori come gli enhancer o gli RNA non codificanti, come è possibile fare con queste tecniche. Sono state sollevate obiezioni al termine “editing”, paragonando l'editing genomico a un editor di testi preciso e prevedibile, quando in realtà la conoscenza delle conseguenze di tali interventi è limitata [5, 6]. L'editing genomico è stato anche definito «ingegneria del genoma», che implica un intervento sul genoma maggiore rispetto al semplice “editing” [7], e la Commissione Europea lo ha definito «nuove tecniche genomiche» [8]. In questo articolo, utilizziamo la terminologia di editing genomico per includere tecniche come la mutagenesi diretta da oligonucleotidi (ODM), le nucleasi a dito di zinco (ZFN), le nucleasi effettrici simili agli attivatori della trascrizione (TALEN), meganucleasi e tecniche di Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated (CRISPR/Cas) [9,10,11,12], con CRISPR/Cas che è diventata la tecnologia di editing genomico più utilizzata [13].
Tutte le tecnologie di ingegneria genetica, sia di prima che di seconda generazione, mirano a modificare direttamente i genomi. Vale a dire, cambiare il materiale genetico (di solito non solo il DNA genomico, ma anche potenzialmente l'RNA e l'epigenoma) di un organismo direttamente, senza accoppiamento, introducendo nella cellula materiale genetico o materiale che attua una modifica del materiale genetico. Il materiale introdotto nella cellula viene prodotto, o almeno manipolato, in laboratorio dall'uomo, cioè con tecniche in vitro. Questo concetto di modifica diretta del materiale genomico è alla base del concetto e della definizione di OGM nell'UE (Direttiva UE n. 2001/18/CE, [14]) e di organismo vivente modificato nel Protocollo di Cartagena sulla biosicurezza [15].
Le preoccupazioni relative ai potenziali impatti negativi degli OGM sull'ambiente derivanti dalla coltivazione e sui consumatori animali e umani hanno portato alla richiesta di una valutazione del rischio per gli OGM prima della coltivazione e della commercializzazione nell'UE, ai sensi della Direttiva UE n. 2001/18/CE [14], e in molte altre regioni e paesi del mondo. Una preoccupazione fondamentale riguardo agli OGM è che la modifica diretta del materiale genetico da parte delle tecnologie di ingegneria genetica possa involontariamente interferire con l'espressione ben orchestrata dei geni o con i complessi percorsi biochimici che operano all'interno di un organismo. Ad esempio, le irregolarità genomiche causate dal DNA ricombinante hanno dato origine a varianti di RNA non volute [16] o a metaboliti secondari alterati [17]. Pertanto, le caratteristiche biologiche e biochimiche dell'OGM potrebbero essere modificate in modo da avere un impatto sui consumatori e/o sull'ambiente. Inoltre, anche la nuova caratteristica conferita dall'ingegneria genetica, ad esempio la tolleranza agli erbicidi nelle piante, è fonte di preoccupazione, poiché può avere conseguenze sui sistemi agricoli, sull'ambiente e spesso sulla sicurezza degli alimenti e dei mangimi [18, 19]. Inoltre, nell'UE è necessario un sistema di tracciabilità ed etichettatura che consenta di separare gli alimenti geneticamente modificati da quelli non geneticamente modificati per consentire la scelta dei consumatori e il monitoraggio di eventuali effetti avversi sulla popolazione umana dopo l'immissione in commercio degli OGM.
Nell'UE, gli organismi geneticamente modificati devono essere sottoposti a una valutazione del rischio sia ambientale sia per gli alimenti e i mangimi, come è richiesto per gli OGM di prima generazione [20]. L'Autorità europea per la sicurezza alimentare (EFSA) ha elaborato linee guida per la valutazione del rischio di piante e animali geneticamente modificati per l'ambiente [21, 22] e per alimenti e mangimi [23,24,25] nell'ambito della normativa europea. Tuttavia, le tecniche di editing genomico sono sostanzialmente diverse dalle tecniche di ingegneria genetica di prima generazione. Pertanto, le linee guida per la valutazione del rischio dovranno essere esaminate, e potenzialmente riviste, per garantire che tengano conto degli effetti indesiderati causati dal processo di editing genomico. L'EFSA ha emesso un parere sulla valutazione del rischio per l'editing genomico delle piante in cui i geni sono inseriti con tecniche di nucleasi-3 (SDN-3) e ha ricevuto dalla Commissione il mandato di produrre un parere sull'applicabilità di tali rischi alle piante geneticamente modificate non portatrici di nuovi geni, ossia con tecniche di nucleasi-1 (SDN-1) e nucleasi-2 (SDN-2). Il parere scientifico è atteso per la fine del 2020 [27]. L'EFSA non ha ancora ricevuto il mandato di elaborare linee guida specifiche per la valutazione del rischio degli animali geneticamente modificati.
In questa sede forniamo una panoramica delle tecniche di editing genomico e descriviamo gli effetti indesiderati specifici legati alla loro applicazione sulle piante e gli animali. Forniamo esempi di applicazioni destinate al mercato dell'editing genomico in agricoltura e forniamo prove del fatto che l'editing genomico può dare origine a organismi con caratteristiche che differiscono in modo significativo da quelle esistenti sviluppate dall'allevamento convenzionale e dagli OGM di prima generazione. Infine, esaminiamo le considerazioni per la valutazione del rischio degli OGM sviluppati con l'editing genomico nell'UE.
Caratterizzazione tecnica delle nuove tecniche di ingegneria genetica
Tecniche di editing genomico
Editing genomico è il termine collettivo per numerose nuove tecniche di ingegneria genetica. La maggior parte di esse (ad esempio ZFN, TALEN, CRISPR/Cas9) comprende nucleasi site-directed (SDN), che inducono rotture a doppio filamento (DSB) del DNA in siti target specifici e predefiniti. In questo modo si attivano i meccanismi di riparazione propri della cellula e si possono verificare alterazioni della sequenza del DNA. Altre tecniche, basate sul sistema CRISPR/Cas, includono quelle che inducono una rottura in un solo filamento di DNA per aumentare la specificità e quelle che possono indurre cambiamenti nell'RNA o nell'epigenoma [28, 29]. L'ODM non utilizza SDN, ma è diretto da brevi oligonucleotidi sintetici che vengono introdotti nelle cellule vegetali dove mediano cambiamenti di sequenza diretti in loci genomici specifici e predefiniti e si suppone che vengano degradati dai processi cellulari [12, 30]. L'editing genomico può essere applicato a piante, animali e microrganismi [9] e anche all'uomo, ad esempio per uso terapeutico, sebbene le applicazioni sull'uomo esulino dall'ambito di questa revisione e non siano considerate OGM dalla legislazione dell'UE ai sensi della direttiva 2001/18/CE [14].
Le ZFN e le TALEN sono sistemi basati su proteine che utilizzano proteine ingegnerizzate per riconoscere la sequenza bersaglio del DNA e indurre una DSB del DNA mediante un dominio di nucleasi (ad esempio Fok I) in un sito predefinito nel genoma di un organismo bersaglio. Negli ultimi anni queste tecniche sono state ampiamente superate dal sistema CRISPR/Cas [13]. Ciononostante, alcuni prodotti sviluppati con queste tecniche precedenti possono essere coltivati e venduti, almeno negli Stati Uniti [31], ad esempio la soia con contenuto di acidi grassi alterato sviluppata dall'azienda Calyxt [32], ed è possibile che in futuro altri prodotti ottenuti con queste tecniche precedenti entrino nel mercato. L'attenzione di questa rassegna si concentra sui sistemi CRISPR/Cas, di cui vengono forniti solo brevi dettagli tecnici, ma che sono trattati in modo approfondito altrove [33,34,35]. In breve, il sistema CRISPR/Cas consente di indirizzare un'endonucleasi (ad esempio Cas9 dello Streptococcus pyogenes) verso specifiche regioni genomiche utilizzando un RNA guida (gRNA) [10, 11]. Il gRNA è progettato in base al locus/loci genomico che deve essere alterato. Cas9 interagisce con il gRNA e, al riconoscimento della sequenza bersaglio, introduce un DSB del DNA in quella parte del genoma [36]. I DSB a DNA attivano successivamente i meccanismi di riparazione delle estremità non omologhe (NHEJ) e di riparazione diretta dall'omologia (HDR) della cellula [37,38,39,40]. La via NHEJ è nota per essere soggetta a errori e spesso produce sostituzioni di basi, inserzioni o delezioni (indels) nei siti di rottura del DNA [41]. Queste alterazioni possono generare mutazioni frameshift o interrompere importanti domini funzionali, che possono, ad esempio, disturbare il funzionamento dei geni bersaglio [42].
Studi di cinetica e di fedeltà dimostrano che, quando la cellula tenta di riparare la rottura del doppio filamento di DNA riportandola alla sua struttura originale, l'applicazione della nucleasi darà tipicamente luogo a una cellula o a un organismo in cui il sito bersaglio è alterato [43]. Per questo motivo, la riparazione NHEJ viene perseguita per le applicazioni di knockout genico. La via HDR utilizza modelli donatori di DNA esogeno per introdurre sostituzioni nucleotidiche e inserzioni di DNA nei siti bersaglio [44, 45]. Le applicazioni di editing genomico che utilizzano le SDN possono essere utilizzate per introdurre cambiamenti di piccole dimensioni e non diretti (SDN-1) o cambiamenti di sequenza diretti (SDN-2 e SDN-3) in loci genomici specifici e predefiniti [46]. Gli approcci SDN-3 prevedono l'inserimento di costrutti transgenici in posizioni specifiche e predefinite (incluso il gene-stacking) [47]. Le modifiche in più punti del genoma sono possibili utilizzando approcci multiplexing, che mirano a più geni contemporaneamente, o applicazioni ripetute utilizzando più gRNA [34, 48, 49].
L'endonucleasi CRISPR/Cas più comunemente utilizzata è Cas9, ma ne sono state impiegate anche altre, come CRISPR/Cpf1 (o Cas12a) [48, 50, 51]. Una variante cataliticamente inattiva di Cas9 (dead Cas9 o dCas9) è stata sviluppata e fusa con diversi domini funzionali per varie applicazioni [52], come il base editing [53], l'editing di modifiche epigenetiche [54, 55] o il silenziamento trascrizionale [52, 56].
Nel base editing, la dCas9 è accoppiata a enzimi che portano alla conversione irreversibile di una specifica base del DNA in un'altra, senza richiedere DSB del DNA nella sequenza bersaglio [53, 57]. Il base editing è stato oggetto di diversi studi di prova nelle piante [58, 59] e negli animali [60, 61]. Finora, il base editing può generare solo le quattro mutazioni di transizione (C-T, G-A, A-G e T-C) [53, 57], ma non è ancora possibile eseguire le otto mutazioni di trasversione (C-A, C-G, G-C, G-T, A-C, A-T, T-A e T-G) perché le pirimidine e le purine hanno strutture molecolari completamente diverse.
La Cas9 morta può anche essere accoppiata a modificatori epigenetici come le DNA metiltransferasi o le istone acetilasi per introdurre cambiamenti nell'epigenoma di una cellula bersaglio [29]. L'epigenoma è modellato attraverso modifiche biochimiche della sequenza del DNA stesso (ad esempio, metilazione o demetilazione del DNA) o degli istoni associati (ad esempio, acetilazione, metilazione o fosforilazione) [54, 62, 63]. L'epigenoma regola in modo ben orchestrato l'espressione genica in tutti i tessuti ed è indispensabile per il normale sviluppo e funzionamento di un organismo [64, 65].
Ulteriori varianti di Cas sono in fase di proof of concept [trad. prova di fattibilità]. Recentemente, è stato descritto l'editing “prime” in cellule umane, [66] riso e grano [67,68,69]. Questo sviluppo della tecnologia CRISPR/Cas consente di introdurre nel DNA inserzioni e delezioni mirate, nonché tutte le possibili trasformazioni da base a base. Essenzialmente, il prime editing utilizza un Cas9 modificato che introduce una rottura a singolo filamento nel sito target del genoma ed è collegato a una trascrittasi inversa. Un determinato RNA di prime editing (pegRNA) specifica il sito target del DNA e codifica il modello desiderato che viene convertito in DNA dalla trascrittasi inversa. Il prime editing ha lo scopo di aumentare l'efficienza di generare modifiche mirate del DNA rispetto all'HDR mediato da DSB del DNA e di ridurre gli effetti fuori bersaglio rispetto al sistema CRISPR/Cas9 classico. Gli effetti off-target sono destinati a ridursi poiché il prime editing intacca solo un filamento di DNA, non attivando così la NHEJ, soggetta a errori.
LwaCas13a di Leptotrichia wadei è stato descritto e adottato per l'editing dell'RNA [70, 71]. Cas13a è strutturalmente diverso da Cas9 e può essere utilizzato per tagliare mRNA specifici. Analogamente agli approcci CRISPR/Cas9, Cas13a viene reclutato su un mRNA bersaglio mediante un crRNA (RNA CRISPR), che lo lega e lo taglia [70]. Cas13a è stata utilizzata per l'abbattimento mirato di trascritti endogeni in protoplasti di riso con livelli di abbattimento paragonabili a quelli dell'interferenza a RNA [70]. Infine, è stata sviluppata anche una forma enzimaticamente inattiva di Cas13 (dead Cas13, dCas13) per l'editing dell'RNA attraverso una adenosina deaminasi che agisce sull'RNA 2 (ADAR2) [72], che consente l'editing delle basi nella sequenza bersaglio del rispettivo mRNA senza alterare le sequenze di DNA sottostanti. Al momento non è noto in che misura queste nuove forme di editing genomico diano luogo a irregolarità genomiche, poiché le ricerche in materia non sono ancora state condotte.
Tecniche di ingegneria genetica di prima generazione utilizzate per l'editing genomico delle piante
Le tecniche di ingegneria genetica di prima generazione sono ancora comunemente utilizzate per introdurre i componenti CRISPR/Cas nelle cellule vegetali. I componenti possono essere veicolati sotto forma di DNA, RNA o ribonucleoproteine (RNP) tramite trasformazione del DNA mediata da Agrobacterium, bombardamento di particelle o trasfezione di protoplasti nelle cellule riceventi. Se si utilizzano plasmidi per trasportare i reagenti CRISPR/Cas nelle cellule per un'espressione stabile, si ricorre all'Agrobacterium tumefaciens o al bombardamento di particelle e le cellule trasformate vengono selezionate utilizzando geni marcatori come la resistenza agli antibiotici. I transgeni contenenti i componenti CRISPR/Cas sono inseriti in siti casuali del genoma, inducendo potenzialmente irregolarità genomiche al momento dell'integrazione, e possono essere rimossi successivamente per segregazione utilizzando la riproduzione convenzionale.
L'espressione genica transitoria di CRISPR/Cas può essere ottenuta senza integrazione del transgene, introducendo un plasmide che codifica i componenti di CRISPR/Cas in cellule vegetali senza geni marcatori selezionabili. Una delle finalità di questa tecnica di somministrazione è quella di ridurre le irregolarità genomiche create dall'inserimento dei transgeni. Il mais ceroso modificato geneticamente di Dupont Pioneer è un esempio di questo approccio [73]. Tuttavia, esiste la possibilità che il plasmide o il DNA modello introdotto (o suoi frammenti) si integri involontariamente nel genoma dell'ospite [73,74,75,76,77].
La somministrazione di CRISPR/Cas senza DNA è stata sviluppata utilizzando RNP preassemblate nelle piante, per lo più mediante bombardamento di particelle o trasfezione di protoplasti [78,79,80]. Le RNP sono in grado di tagliare la regione bersaglio immediatamente dopo la consegna nel nucleo e vengono quindi degradate rapidamente, per cui ci si aspettano meno effetti fuori bersaglio [33]. Tuttavia, l'aumento della specificità delle RNP, che limita il loro modo d'azione a un tempo limitato, porta anche a una riduzione del clivaggio on-target. Pertanto, è necessario considerare un equilibrio tra l'efficienza di clivaggio on-target e gli effetti off-target [81]. Esempi di prova di editing genomico CRISPR/Cas con RNP includono mela, uva, mais e grano [74, 75, 79].
La rigenerazione di piante intere da protoplasti è ancora una sfida per la maggior parte delle colture importanti dal punto di vista agronomico. I protoplasti sono singole cellule isolate enzimaticamente dai tessuti vegetali, che possono formare una nuova pianta. Una sfida importante è ancora l'isolamento di protoplasti intatti da materiale tissutale [82]. Un'altra sfida che si presenta durante la rigenerazione di piante intere da protoplasti è l'instabilità genomica (cioè l'instabilità cromosomica e segmentale), ad esempio nelle patate [83]
Tecniche di ingegneria genetica per l'editing genomico negli animali da allevamento
La metodologia per l'ingegneria genetica degli animali da allevamento è molto diversa da quella delle piante, perché le piante possono rigenerarsi da cellule somatiche, mentre gli animali possono svilupparsi solo da cellule germinali. L'uso di embrioni solleva problemi etici e di benessere, soprattutto nei vertebrati, poiché in un tipico esperimento di ingegneria genetica (compreso l'editing genomico) vengono effettuate centinaia di trasformazioni genetiche, ciascuna delle quali richiede un embrione [84, 85]. Gli embrioni trasformati con la modifica desiderata e senza apparenti modifiche indesiderate vengono selezionati per l'impregnazione, ma altri embrioni vengono persi durante l'impregnazione e la gravidanza [84, 85]. Pertanto, per l'ingegneria genetica degli animali è necessario un numero considerevolmente elevato di embrioni, il che è eticamente discutibile. I metodi di introduzione e rigenerazione del DNA nei vertebrati sono gli stessi sia per l'ingegneria genetica di prima generazione sia per l'editing genomico. I due metodi principali per generare animali geneticamente modificati sono il trasferimento nucleare di cellule somatiche (clonazione) e l'iniezione citoplasmatica (iniezione pronucleare o microiniezione) [86, 87]. Con la clonazione, le cellule primarie di un animale adulto (ad esempio, fibroblasti) vengono coltivate in coltura cellulare e trasfettate (ad esempio, mediante trasfezione virale o elettroporazione) con componenti CRISPR/Cas. Dopo aver selezionato le alterazioni desiderate del DNA, la cellula somatica dal genoma modificato viene fusa con una cellula uovo enucleata per creare un embrione vitale dal genoma modificato. La microiniezione, invece, prevede l'iniezione diretta del complesso di editing genomico nel citoplasma di uno zigote. Tuttavia, la microiniezione ha riportato una bassa efficienza di editing e comunemente risulta in un mosaicismo (una miscela di alleli modificati e non modificati) [88]. A causa delle difficoltà legate alla microiniezione, i metodi di clonazione sono ancora ampiamente utilizzati nel processo di editing genomico degli animali [86, 87]. La clonazione porta comunemente a difetti alla nascita, aborti e morte precoce postnatale [86]. Pertanto, soprattutto per gli animali vertebrati, gli esperimenti di editing genomico comportano problemi etici e di benessere.
Effetti indesiderati associati all'editing genomico
Sebbene le tecniche di editing genomico siano spesso descritte come precise in termini di modifiche previste al materiale genetico [89,90,91,92], sono state segnalate irregolarità genomiche, tra cui effetti indesiderati fuori bersaglio (OTE), effetti on-target e riarrangiamenti cromosomici [93, 94]. Gli effetti indesiderati possono verificarsi con tutte le tecniche di editing genomico, ma i sistemi CRISPR/Cas sono lo strumento di editing genomico più frequentemente utilizzato negli studi. Pertanto, la nostra attenzione si concentra principalmente sugli effetti indesiderati associati a questa tecnica.
Effetti fuori bersaglio delle applicazioni CRISPR/Cas
Gli effetti fuori bersaglio sono il clivaggio e la conseguente modifica del DNA in siti genomici diversi dal sito bersaglio. Gli effetti off-target sono una delle principali preoccupazioni relative agli effetti indesiderati generati dai sistemi CRISPR/Cas [3, 84, 95]. Gli effetti fuori bersaglio sono stati dimostrati in diverse piante coltivate, tra cui riso, soia, mais e orzo [93, 95,96,97,98,99] e in animali da allevamento come i maiali [100], nonché in ratti e topi [101, 102]. Gli effetti fuori bersaglio si verificano su sequenze di DNA con anche 3-5 coppie di basi non corrispondenti nella parte distale del protospazio adiacente (PAM) del gRNA, poiché esiste un certo grado di tolleranza per le non corrispondenze tra il DNA bersaglio e l'RNA guida [95, 103,104,105]. Alcuni tipi di gRNA hanno un alto grado di specificità, mentre altri sono più promiscui [95]. Pertanto, una progettazione accurata e affidabile dei gRNA, basata su dati genomici preesistenti, può ridurre al minimo, ma non necessariamente eliminare, la possibilità di effetti fuori bersaglio. Inoltre, la natura dei componenti dell'editing genomico (cioè se vengono utilizzati RNP o plasmidi), l'organismo bersaglio (cioè la complessità del suo genoma), la durata dell'esposizione alla nucleasi, la farmacocinetica dei componenti forniti, il tipo di variante Cas utilizzata e la quantità di nucleasi applicata possono influenzare la specificità e il numero di eventi fuori bersaglio [103, 106,107,108]. Se si verificano effetti fuori bersaglio nei geni codificanti per le proteine, potrebbero verificarsi mutazioni con perdita di funzione o alterazioni delle funzioni delle proteine. Allo stesso modo, alterazioni involontarie in sequenze di DNA non codificanti, promotori, introni, terminatori o insulatori potrebbero alterare l'espressione genica. Pertanto, l'individuazione degli effetti fuori bersaglio è un passo essenziale per determinare la sicurezza di un organismo geneticamente modificato per l'ambiente, gli alimenti e i mangimi.
Si sta cercando di rendere il sistema CRISPR/Cas meno incline agli effetti fuori bersaglio, ad esempio sembra che il sistema CRISPR-Cpf1 abbia una maggiore specificità rispetto a CRISPR/Cas9, il che aumenta anche le possibilità di colpire più geni [109, 110]. Anche la composizione dei nucleotidi intorno alla sequenza PAM, il contenuto di GC del gRNA e la struttura della cromatina della sequenza bersaglio hanno un'influenza sull'attività fuori bersaglio [111, 112]. È interessante notare che è stato suggerito che l'esito del processo di riparazione vegetale è influenzato anche dalle proprietà della sequenza locale nel sito bersaglio [113, 114].
Sebbene l'ODM possa comportare modifiche solo a un piccolo numero di basi del DNA, esiste la possibilità di effetti off-target e on-target. Sebbene non vi siano ancora dati pubblicati che esaminino la frequenza degli effetti indesiderati con l'ODM [4, 13, 93], ciò non significa che non si verifichino. Non si può escludere la possibilità di integrazione degli oligonucleotidi [4].
Effetti fuori bersaglio associati al base editing e all'editing epigenetico
I base editors inducono livelli più bassi di inserzioni e delezioni non volute rispetto alle applicazioni SDN che inducono DSB [53, 115], ma hanno il potenziale di modificare tutti i nucleotidi target entro una finestra di editing di cinque coppie di basi [53]. Recenti scoperte mostrano un aumento delle mutazioni fuori bersaglio con base editors citosiniche (CBE) rispetto a base editors adeniniche (ABE) in embrioni di riso e di topo [116, 117]. Sorprendentemente, le mutazioni fuori bersaglio, indotte dai CBE, si sono verificate prevalentemente in regioni geniche attivamente trascritte che non sono state descritte dagli strumenti di predizione in silico [117].
I base editors possono anche generare editing off-target a livello trascrittomico dell'RNA, oltre all'editing del DNA [118]. Questi effetti sono stati riscontrati sia nei CBE che negli ABE e si sono verificati indipendentemente dall'RNA guida utilizzato e dall'editing del DNA fuori bersaglio. Ciò dimostra che gli effetti fuori bersaglio indotti dai base editors sono multidimensionali e illustra l'importanza di una valutazione dettagliata degli effetti fuori bersaglio, non solo del DNA, ma anche dell'RNA in questi organismi, soprattutto se il DNA che codifica i base editors è integrato nel genoma. Questi effetti fuori bersaglio possono portare a mutazioni missense (cioè la sostituzione di un diverso amminoacido nella proteina risultante) o nonsense (cioè la generazione di una proteina tronca generando un codone di stop) potenzialmente generando una composizione proteica alterata o la generazione di varianti di splice [118]. Nel tentativo di ridurre gli effetti indesiderati e migliorare le possibili applicazioni future, questi sistemi sono in fase di ulteriore revisione [119, 120].
L'editing dell'epigenoma può indurre cambiamenti aspecifici a livello genomico nell'epigenoma [121], che potrebbero portare a un'alterazione dell'espressione genica in queste cellule. Sembra inoltre che, finora, la specificità di questi modificatori epigenetici di dCas9 non possa essere prevista in modo affidabile [122].
Effetti indesiderati on-target associati alle applicazioni di CRISPR/Cas
Oltre agli effetti fuori bersaglio, sono state osservate alterazioni non intenzionali a livello del sito bersaglio o nelle sue immediate vicinanze [94, 123,124,125]. Usiamo l’espressione «effetti indesiderati on-target» per descrivere queste alterazioni indesiderate in prossimità del sito bersaglio, sebbene questi cambiamenti molecolari possano verificarsi anche più lontano, persino a distanza dal sito bersaglio. Dopo l'applicazione di CRISPR/Cas9 in cellule staminali embrionali di topo e in cellule umane differenziate sono state rilevate grandi delezioni, inserzioni e inversioni cromosomiche [94]. Tali riarrangiamenti cromosomici complessi possono essere identificati mediante PCR a lungo raggio o piattaforme di sequenziamento di nuova generazione a lettura lunga, come la Pacific BioSciences o la tecnologia Oxford Nanopore. Tuttavia, queste tecniche sono raramente utilizzate per la genotipizzazione di routine delle mutazioni indotte da CRISPR/Cas nelle piante, quindi è probabile che questi effetti on-target siano rimasti inosservati in molti studi [126]. Piccole inserzioni o delezioni nel sito bersaglio possono causare l'interruzione del meccanismo di splicing alternativo, con conseguente salto dell'esone a causa dell'interruzione dei potenziatori dello splicing esonico [123, 127]. Questa errata lettura del DNA ha il potenziale di produrre proteine aberranti, come confermato dal rilevamento di una proteina aberrante risultante dall'applicazione di CRISPR/Cas9 a una coltura cellulare umana [127]. Lo splicing alternativo si verifica in tutti gli animali multicellulari e nelle piante, ma in misura maggiore negli animali rispetto alle piante [128]. Ciò suggerisce che qualsiasi alterazione dello splicing alternativo potrebbe avere un effetto maggiore negli animali rispetto alle piante. Gli effetti a valle dello splicing alternativo possono rimanere inosservati a meno che non si applichino tecniche trascrittomiche o proteomiche per identificare gli mRNA e le proteine generate in modo aberrante. Inoltre, è stato riscontrato che grandi delezioni indotte da un singolo gRNA eliminano interi esoni causando lo skipping degli esoni in linee cellulari [124, 129].
È stato dimostrato che sia la riparazione mediata da HDR sia quella mediata da NHEJ causano inserzioni multiple indesiderate testa-coda di modelli donatori di DNA nel sito bersaglio durante la generazione di modelli di topi knockout condizionali [130]. L'analisi PCR applicata in modo convenzionale non è riuscita a identificare queste inserzioni. Pertanto, è essenziale convalidare l'integrità delle regioni di DNA bersaglio dopo l'applicazione di CRISPR/Cas9 utilizzando una combinazione di tecniche analitiche adeguatamente sensibili come la qPCR, la PCR digitale a gocce e il southern blotting [130].
La multifunzionalità dei geni, in particolare negli animali in virtù della maggiore estensione dello splicing alternativo, può portare a conseguenze indesiderate dall'editing genomico. Un gene reso disfunzionale (knock out) da una piccola delezione o addirittura da una modifica di base, può avere prodotti che svolgono una funzione essenziale in altre parti della cellula [131]. Ciò potrebbe causare errori nel metabolismo cellulare, compresa la produzione di proteine. La comprensione delle implicazioni di alcune conseguenze dell'editing genomico richiederà ulteriori ricerche, soprattutto perché molti degli studi che esaminano gli effetti on-target utilizzano colture cellulari, comprese cellule umane e animali. Ad esempio, è stato dimostrato che l'applicazione di CRISPR/Cas9 in cellule staminali pluripotenti umane e in cellule epiteliali del pigmento retinico provoca l'accumulo di mutazioni nel gene p53. Queste cellule sono state esposte a una selezione contro la p53 funzionale [132, 133] che potrebbe portare a un successivo aumento dell'accumulo di mutazioni. Sono necessarie ulteriori ricerche per determinare quanto questo effetto possa essere rilevante per le applicazioni agricole di CRISPR/Cas destinate al mercato, in particolare per le mutazioni indotte da CRISPR/Cas9 nel SOG1 delle piante, che ha funzioni simili a quelle di p53 negli animali [134].
Integrazione involontaria di componenti CRISPR/Cas o di DNA plasmidico
Quando i componenti CRISPR/Cas vengono introdotti nelle cellule sotto forma di plasmidi, sono stati segnalati eventi di integrazione aggiuntiva non intenzionale di questo DNA o di suoi frammenti sia nelle piante che negli animali, e nei casi in cui il plasmide era destinato a eseguire l'editing genomico senza alcuna integrazione del DNA, si è integrato involontariamente [74, 76, 130, 135]. Questo può riferirsi sia ai componenti CRISPR/Cas sia al backbone plasmidico. Ad esempio, in uno studio, il modello di DNA che codifica CRISPR/Cas9 non è stato rilevato solo nella posizione target della soia, come previsto, ma anche in altre posizioni genomiche multiple, apparentemente casuali [135]. In un altro studio, le sequenze CRISPR/Cas sono state trovate in più siti genomici, mostrando una microomologia nei siti di integrazione del transgene, indicando che l'integrazione delle sequenze CRISPR/Cas potrebbe non essere completamente casuale [136].
È stata riportata anche l'integrazione involontaria di frammenti di DNA codificante CRISPR/Cas nel genoma di altre piante [74]. L'integrazione involontaria di un plasmide nel genoma è stata scoperta tramite il sequenziamento dell'intero genoma (WGS) [76] nel bestiame, quando i TALEN sono stati utilizzati per inserire un allele del gene POLLED in un fibroblasto embrionale bovino per generare bovini da latte senza corna [137]. Tuttavia, inizialmente gli sviluppatori non hanno rilevato l'integrazione plasmidica involontaria nella loro analisi, probabilmente perché il backbone plasmidico non era incluso nell'allineamento di sequenza, il rumore elevato nel locus target, il segnale limitato dei dati di sequenziamento e/o le condizioni di PCR non sensibili per rilevare le integrazioni [76, 77].
Effetti indesiderati indotti dall'applicazione di tecniche di ingegneria genetica di prima generazione
Sebbene l'editing genomico consenta di modificare il DNA in un sito bersaglio, questa pretesa precisione potrebbe non valere per la consegna e l'integrazione degli strumenti. L'uso di tecniche di ingegneria genetica di prima generazione per integrare il DNA che codifica i componenti CRISPR/Cas comporta l'inserimento in una posizione casuale nel genoma, spesso con copie multiple e difettose (ad esempio parziali) [138, 139]. L'integrazione casuale del DNA di trasferimento (T-DNA) da trasformazioni vegetali mediate da Agrobacterium (e dei suoi frammenti) potrebbe avere conseguenze indesiderate per l'OGM risultante, come l'interruzione di geni importanti per la crescita o lo sviluppo della pianta. In alternativa, il T-DNA può integrarsi in regioni del genoma che sono scarsamente o instabilmente espresse quando vengono coltivate in campo. Ad esempio, l'integrazione di frammenti di T-DNA può causare la formazione di varianti di mRNA non volute [16]. I risultati di Jupe et al. [141] evidenziano la necessità di ricercare irregolarità sia nel genoma che nell'epigenoma, in particolare nelle regioni che fiancheggiano i siti di integrazione, degli OGM trasformati da Agrobacterium tumefaciens. Le piante trasformate con metodi di somministrazione diretta, come il bombardamento di particelle, mostrano riarrangiamenti del DNA genomico e dei loci transgenici [140].
L'inserimento di materiale genetico può dare origine a irregolarità genomiche, tra cui grandi riarrangiamenti genomici, delezioni, inserzioni, mutazioni a livello genomico e alterazioni epigenetiche in prossimità del sito di integrazione [139, 141,142,143,144].
Una volta che i componenti CRISPR/Cas inseriti hanno apportato una modifica al materiale genomico dell'organismo (di solito il DNA), i loro transgeni possono essere rimossi dalle piante mediante incrocio con le linee parentali. Di conseguenza, almeno in teoria, gli organismi risultanti dalle applicazioni SDN-1 e SDN-2 di editing genomico non contengono geni inseriti, ma è importante verificare la completa assenza di geni inseriti, comprese le sequenze backbone dei vettori [13, 145].
Potenziali applicazioni dell'editing genomico in agricoltura
Colture geneticamente modificate che contengono nuove combinazioni genomiche
Molte specie vegetali hanno genomi complessi che presentano una notevole diversità sia nelle dimensioni che nella struttura [146]. Le sfide per la selezione delle piante includono la poliploidia, un gran numero di geni omologhi, l'eterozigosi, il DNA ripetitivo e il linkage drag [trascinamento del legame]. Le principali colture agricole come la colza, il grano, la patata, il cotone, la mela e la canna da zucchero sono poliploidi, cioè combinano più di due serie appaiate di cromosomi, che provengono dalla stessa specie (autoploidi) o da specie affini (allopoliploidi) [147]. Ad esempio, la colza (Brassica napus) è allotetraploide in quanto consiste di due diversi set di cromosomi diploidi, uno proveniente da B. oleracea e uno da B. rapa [148]. Inoltre, i genomi delle piante contengono spesso regioni genomiche altamente ripetitive a causa di elementi trasponibili che presentano grandi dimensioni del genoma. Ad esempio, il genoma del grano alloesaploide è costituito da circa 14,5 × 109 basi, composto da tre sottogenomi strettamente correlati, ciascuno dei quali contiene un insieme di geni omologhi [149].
La complessità dei genomi delle piante rappresenta una seria sfida per la generazione di alterazioni genetiche che richiedono il targeting di più geni da parte delle tecniche tradizionali di riproduzione e mutagenesi che utilizzano sostanze chimiche o radiazioni per introdurre mutazioni nelle piante [150]. Le strategie per superare i limiti dell'allevamento convenzionale sono state sviluppate utilizzando l'editing genomico. Le tecniche di editing genomico, come la CRISPR/Cas, consentono alterazioni complesse dei genomi in un modo che finora non era possibile [151]. Gli approcci multiplexing, che combinano più gRNA, consentono di mirare e alterare più alleli, tutti i membri di una famiglia di geni o diversi geni funzionali [13, 152, 153]. Le applicazioni di editing genomico multiplexing sono state utilizzate per modificare molte delle principali piante coltivate [154,155,156]. Nella Camelina sativa, ad esempio, che è una pianta alloesaploide, è stato ottenuto un knockout completo di tutti gli alleli di FAD2 (desaturasi degli acidi grassi 2) utilizzando CRISPR/Cas9 [157]. Questi cambiamenti sarebbero estremamente difficili, se non impossibili, da ottenere con la mutagenesi tradizionale o tramite mutazioni spontanee in natura. Il genoma della camelina contiene tre sottogenomi in due copie, quindi ogni gene esiste in sei copie [158, 159]. Per eliminare tutti gli alleli di FAD2 con la mutagenesi tradizionale, si dovrebbero indurre tre mutazioni complementari nel gene FAD2 in ciascun locus genetico in piante separate e successivamente rendere omozigote ciascuna mutazione. Queste piante mutanti dovrebbero poi essere incrociate tra loro per ottenere una singola pianta che contenga tutte le mutazioni. La generazione simultanea di una tripla mutazione omozigote di FAD2 che provochi un effettivo knockout genico mediante mutagenesi chimica o fisica è estremamente improbabile, così come lo è la comparsa di una tale pianta di camelina a causa di mutazioni spontanee.
Le tecniche di editing genomico possono superare le limitazioni del legame genetico tra i diversi caratteri talvolta presenti nell'allevamento convenzionale delle piante [151, 160]. Se un gene desiderato è collegato a un gene con effetti negativi, ad esempio sulla resa o sulla forma dei frutti, è possibile utilizzare l'editing genomico per interrompere questo legame eliminando il gene indesiderato. In questo modo si elimina la necessità di un eccessivo backcrossing per rompere il legame. La separazione dei geni legati è impegnativa e macchinosa con i metodi di selezione classici, ma è aiutata da biotecnologie come la selezione assistita da marcatori e la selezione genomica [161].
I limiti della mutagenesi tradizionale hanno portato a una mancanza di esperienza normativa con le piante che presentano nuovi caratteri (multipli) più complessi (ad esempio, l'alterazione delle vie metaboliche), poiché questi non sono stati generati dalla mutagenesi tradizionale o dagli approcci del DNA ricombinante, ma possono ora essere facilmente indotti dall'editing genomico. La Tabella 1 fornisce esempi di colture geneticamente modificate che contengono nuove combinazioni genetiche che sarebbero difficili da generare con la mutagenesi tradizionale o con le tecniche di ingegneria genetica di prima generazione.
Tabella 1. Colture geneticamente modificate con nuove caratteristiche
Fonte: Broadening the GMO risk assessment in the EU for genome editing technologies in agriculture
Esempi di piante contenenti nuovi tratti sviluppati da interventi complessi nel rispettivo genoma, ad esempio approcci multiplexing o rimozione del legame genomico utilizzando tecniche di editing genomico, sono mostrati insieme al livello di ploidia delle piante geneticamente modificate, alle dimensioni del loro genoma, all'alterazione genomica prevista, al gene o ai geni target, alla caratteristica associata e alla tecnica di editing genomico.
CRISPR/Cas9, Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9; Mbp, Mega basepair; SDN-1, Site-directed nuclease-1; Gb, Giga basepair; TALENs, Transcription activator-like effector nucleases
Colture genomicamente modificate destinate al mercato
In un'ampia revisione delle applicazioni di editing genomico e del rilevamento degli effetti fuori bersaglio nelle piante, Modrzejewski et al. hanno esaminato sistematicamente le pubblicazioni tra il 1996 e il maggio 2018 [93]. Hanno rilevato che la maggior parte degli studi sull'editing genomico è stata pubblicata a partire dal 2013, a dimostrazione del recente rapido aumento dell'uso delle tecnologie di editing genomico nella produzione di piante geneticamente modificate. La maggior parte delle pubblicazioni sull'editing genomico delle piante esaminate ha utilizzato le tecniche CRISPR/Cas, con un contributo molto minore da parte delle altre tecnologie di editing genomico TALEN, ZFN e ODM.
Nella maggior parte degli studi esaminati, le colture sono state alterate con approcci SDN-1 piuttosto che SDN-2. Hanno indotto mutazioni puntiformi o indelebili senza fornire un modello donatore di DNA, poiché l'efficienza della riparazione diretta per omologia è ancora bassa [93]. Nella loro rassegna [93], Modrzejewski et al. hanno considerato 99 diverse applicazioni in 28 piante diverse destinate al mercato (in contrasto con la ricerca di base). Hanno classificato le applicazioni di editing genomico destinate al mercato quando gli studi soddisfacevano i seguenti criteri: (1) l'editing genomico è stato applicato a una coltura agricola; (2) è stata introdotta una caratteristica che poteva essere interessante per la commercializzazione e (3) la caratteristica mirata si è espressa nella pianta modificata una volta cresciuta [93]. Il riso ha avuto il maggior numero di applicazioni destinate al mercato, seguito da pomodoro, mais, patata, grano e diverse altre colture. Il riso è relativamente facile da rigenerare da colture cellulari, il che facilita l'editing genomico e contribuisce all'elevato numero di applicazioni di editing genomico nel riso. Il riso è anche una coltura molto importante a livello globale, in particolare in Cina, da dove proviene un numero considerevole di ricerche sulle colture sottoposte a editing genomico [162]. Tuttavia, vale la pena notare che, nonostante la ricerca e le prove sul campo di riso geneticamente modificato, non esiste un riso geneticamente modificato coltivato a livello commerciale in Cina o in qualsiasi altra parte del mondo [163].
I tratti nelle piante geneticamente modificate destinate al mercato sono diversi, ma i più comuni sono quelli relativi al valore agronomico, seguiti dalle modifiche compositive (vedi Tabella 2) [93]. La ricerca degli effetti fuori bersaglio può assumere la forma di una ricerca biased [parziale] o unbiased [imparziale]. Nella ricerca biased, vengono utilizzati strumenti in silico per prevedere i possibili siti off-target sulla base della sequenza del gRNA. Questi siti previsti vengono successivamente esaminati per verificare la presenza di cambiamenti fuori bersaglio dopo l'applicazione di CRISPR/Cas utilizzando l'analisi PCR classica. Nella ricerca imparziale, gli approcci WGS sono utilizzati per identificare gli effetti fuori bersaglio a livello genomico e non limitati ai soli siti previsti. Il numero di effetti off-target previsti è risultato molto variabile tra gli studi che hanno eseguito metodi di rilevamento dei bias nelle piante, da zero a oltre 4000 [93]. Come discusso in Modrzejewski et al. [93], il numero di siti off-target previsti dipende da vari fattori: le diverse dimensioni dei genomi e il numero di set cromosomici tra le piante; i diversi strumenti di previsione e analisi utilizzati; il numero di ipotetici mismatch tollerati tra la sequenza bersaglio e il potenziale sito off-target e la progettazione o la selezione dei gRNA per ridurre al minimo gli effetti off-target. Finora, la stragrande maggioranza degli studi sulle piante che utilizzano applicazioni di editing genomico cerca gli effetti fuori bersaglio in modo distorto, analizzando esclusivamente i siti del genoma previsti in silico, mentre una scarsa minoranza di questi studi utilizza approcci WGS imparziali per identificare gli effetti fuori bersaglio [93].
Tabella 2. Caratteristiche delle applicazioni di editing genomico nelle piante destinate al mercato
Fonte: Broadening the GMO risk assessment in the EU for genome editing technologies in agriculture
Animali da allevamento geneticamente modificati
Attualmente non esistono animali da allevamento geneticamente modificati in tutto il mondo e l'unico animale geneticamente modificato approvato per uso alimentare si limita a un salmone geneticamente modificato in Canada e negli Stati Uniti [179]. Un farmaco prodotto da una capra GM è stato approvato per uso medicinale nell'UE, ma da allora è stato ritirato dal mercato comunitario [180, 181]. La produzione di animali GM è stata limitata dalle difficoltà incontrate con le tecniche di modificazione genetica di prima generazione per gli animali [84, 179]. Al contrario, l'editing genomico sembra dare risultati più prevedibili negli animali [84,85,86] e il numero di studi di animali da allevamento geneticamente modificati è in aumento. Sebbene si tratti per lo più di studi di prova, essi indicano che nel prossimo futuro potrebbero esserci applicazioni per l'allevamento e la commercializzazione di animali da allevamento modificati geneticamente come cibo.
Un esame della letteratura scientifica pubblicata dal 2014 al 2019, individuata utilizzando in Google Scholar e Web of Science i termini di ricerca «genome-editing» o «gene-editing» con «animal» e «farm», ha rivelato che un'ampia gamma di tratti è stata ingegnerizzata negli animali da allevamento utilizzando varie tecniche di editing genomico. Sebbene non si tratti di una ricerca esaustiva, l'esame ha fornito esempi di animali da allevamento sottoposti a editing genomico che rientrano in due categorie fondamentali: quelli per l'aumento della produttività (Tabella 3) e quelli per l'aumento dell'efficienza della produzione (Tabella 4), ovvero l'adattamento degli animali da allevamento alle condizioni di allevamento e la modifica della qualità del prodotto animale. La maggior parte (14) degli animali geneticamente modificati riportati nelle tabelle 3 e 4 sono stati prodotti utilizzando l'SDN-1, mentre uno ha utilizzato l'SDN-2 e cinque l'SDN-3. Tuttavia, ci sono molti altri studi sulle applicazioni di editing genomico SDN-1 per migliorare la crescita muscolare e la lunghezza della lana (entrambi i tipi di produttività), aumentando la percentuale di studi che utilizzano SDN-1.
Tabella 3. Esempi di editing genomico negli animali da allevamento per aumentare la produttività
Fonte: Broadening the GMO risk assessment in the EU for genome editing technologies in agriculture
Sono indicati i geni bersaglio, i tratti e la tecnica di editing genomico utilizzata per creare animali da allevamento genomicamente modificati con un aumento della crescita della massa muscolare o della lunghezza della lana e del pelo. I rispettivi riferimenti sono stati esaminati anche per l'analisi degli effetti off-target.
CRISPR/Cas9, clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9; SDN-1, site-directed nuclease-1; TALENs, transcription activator-like effector nucleases; OTEs, effetti fuori bersaglio.
Tabella 4. Esempi di editing genomico negli animali da allevamento per aumentare l'efficienza della produzione
Fonte: Broadening the GMO risk assessment in the EU for genome editing technologies in agriculture
Sono illustrati i geni bersaglio, i tratti e la tecnica di editing genomico utilizzata per creare animali da allevamento genomicamente modificati con una maggiore efficienza produttiva. I rispettivi riferimenti sono stati esaminati anche per l'analisi degli effetti fuori bersaglio.
CRISPR/Cas9, clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9; SDN-1, site-directed nuclease-1; TALENs, transcription activator-like effector nucleases; OTEs, off-target effects; ZNF, zinc finger nucleases
Questi due studi si riferiscono allo sviluppo dello stesso organismo genoma-editato e sono trattati come un unico studio.
Manca un'indagine sistemica della letteratura che esamini gli effetti fuori bersaglio e altri effetti indesiderati negli animali da allevamento geneticamente modificati. Abbiamo esaminato le pubblicazioni delle tabelle 3 e 4 per la loro analisi degli effetti fuori bersaglio. Nessuna analisi per gli effetti fuori bersaglio è stata eseguita in otto dei 19 studi, mentre otto hanno utilizzato metodi di rilevamento distorti (strumenti di previsione in silico e PCR convenzionale) e uno ha utilizzato WGS. Due hanno riportato livelli alterati di citochine o metabolismo (Tabelle 3 e 4). Gli studi alla ricerca di effetti fuori bersaglio negli animali geneticamente modificati seguono uno schema simile alle piante geneticamente modificate, utilizzando prevalentemente metodi di rilevamento distorti con pochissimi approcci WGS imparziali. Nessuno degli studi ha condotto un'analisi approfondita per effetti sul bersaglio non intenzionali, sebbene alcuni abbiano cercato l'integrazione non intenzionale del plasmide. Successivamente è stato scoperto che i bovini senza corna avevano un'integrazione non intenzionale del plasmide stampo contenente la spina dorsale del plasmide e una seconda copia dello stampo nel genoma della mucca [76, 77].
Valutazione del rischio per organismi sviluppati attraverso tecniche di modifica del genoma
Nell'UE, gli organismi geneticamente modificati devono essere sottoposti a valutazioni del rischio sia ambientale che alimentare e dei mangimi, come richiesto per gli OGM di prima generazione [20]. Al momento, ci sono attualmente pochissime applicazioni commerciali dell'editing genomico e queste sono limitate alle applicazioni agricole e in gran parte confinate negli Stati Uniti, dove l'approccio normativo differisce da quello europeo [182]. L'approccio normativo negli Stati Uniti si basa in gran parte sul fatto che i componenti inseriti o gli organismi da cui derivano siano parassiti delle piante, ad es. una tossina nota o una specie invasiva [183]. Questo approccio ha portato il Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti (USDA) a non richiedere una valutazione del rischio ambientale per le piante geneticamente modificate che «avrebbero potuto altrimenti essere sviluppate attraverso tecniche di allevamento tradizionali purché non fossero parassiti delle piante o sviluppate utilizzando parassiti delle piante» [31]. Tuttavia, molte colture che vengono alterate dalle applicazioni di modifica del genoma contengono combinazioni genetiche (che danno origine a nuovi tratti) che finora non sono state sviluppate attraverso tecniche di allevamento tradizionali, anche se non contengono geni inseriti. Sebbene le piante geneticamente modificate destinate all'alimentazione siano probabilmente sottoposte a una valutazione volontaria della sicurezza alimentare prima di essere immesse sul mercato statunitense [184], la mancanza di una valutazione del rischio ambientale per le colture geneticamente modificate negli Stati Uniti è stata accolta con preoccupazioni da scienziati e altre parti interessate, molti dei quali ritengono necessaria la supervisione [182, 185].
Alla fine del 2019, l'USDA Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS) elenca 28 lettere (27 su piante e una su un fungo geneticamente modificati) di aziende e istituti di ricerca che chiedono se i loro prodotti geneticamente modificati rientrano nelle normative sulla biotecnologia. Si ritiene che non soddisfino tutti la definizione di articolo regolamentato ai sensi delle normative sulla biotecnologia degli Stati Uniti. Ciò significa che gli effetti indesiderati, comprese le irregolarità genomiche, non vengono né considerati (inclusa la loro presenza o assenza) né valutati. Inoltre, in molte delle lettere di inchiesta archiviate nell'elenco USDA-APHIS, non viene fornita alcuna informazione sui geni alterati contenuti in questi organismi geneticamente modificati poiché sono considerate informazioni commerciali riservate [31]. Finora, tutte le applicazioni di organismi geneticamente modificati ritenute non regolamentate hanno utilizzato tecniche di ingegneria genetica di prima generazione (ad esempio trasformazione con Agrobacterium tumefaciens o bombardamento di particelle) per inserire in modo casuale il DNA contenente i componenti CRISPR/Cas nel genoma del ricevente.
Attualmente si discute se gli organismi geneticamente modificati possano essere esentati dal regolamento UE sugli OGM, e se il regolamento debba essere rivisto per concentrarsi sul prodotto, piuttosto che sul processo utilizzato per generarli [186]. Un argomento per l'esenzione di alcuni organismi geneticamente modificati include considerazioni sul fatto che i cambiamenti indotti da SDN-1 (o anche SDN-2) siano simili a quelli che potrebbero insorgere spontaneamente e naturalmente o attraverso l'allevamento convenzionale o la mutagenesi tradizionale (cioè non contengono geni inseriti). La base di questa linea di argomentazione è che gli OGM sviluppati dalla mutagenesi tradizionale sono esentati dalle normative UE sugli OGM in base al loro «uso storico sicuro» [187]. Tuttavia, l'editing genomico è una tecnica di ingegneria genetica relativamente nuova e non ha una storia di utilizzo, o addirittura un «uso storico sicuro». Effetti indesiderati come l'integrazione involontaria del DNA, causata dal processo di modifica del genoma, sono stati osservati solo recentemente e con il progredire della ricerca è possibile scoprire altri tipi di effetti indesiderati. Una seconda argomentazione chiede se la precisione dell'editing genomico lo renda meno soggetto a effetti imprevisti rispetto all'allevamento convenzionale o alla mutagenesi tradizionale [188,189,190]. Tuttavia, abbiamo dimostrato qui che l'editing genomico può causare effetti indesiderati specifici e può essere utilizzato per generare nuove combinazioni genetiche che non possono essere facilmente ottenute utilizzando tecniche di allevamento o mutagenesi convenzionali. In un senso più generale, l'editing genomico utilizza SDN e oligonucleotidi, che possono essere classificati come mutageni biologici [191]. Contrariamente ai mutageni chimici o fisici utilizzati nella mutagenesi tradizionale, questi agenti possono interagire in modo mirato con i meccanismi biologici della cellula, a livello del genoma e/o dell'epigenoma. Quindi, la base dei due tipi di tecniche è fondamentalmente diversa e non confrontabile.
Come mostra l'esempio dell'editing genomico nella canna da zucchero (vedi Tabella 1) [192], anche l'applicazione di editing genomico meno invasiva (SDN-1) può facilmente superare l'entità dei cambiamenti realizzabili con le tradizionali tecniche di mutagenesi o mutazioni spontanee, in particolare se applicato ripetutamente. Altri esempi qui descritti dimostrano la gamma di irregolarità genomiche, sia off-target che on-target, che sono state trovate in piante e animali geneticamente modificati dalle applicazioni SDN-1 e SDN-2. Allo stesso modo, anche con SDN-1, possono verificarsi conseguenze indesiderate dell'editing del genoma, come il salto dell'esone. Pertanto, non è possibile presumere che gli organismi geneticamente modificati creati dalle applicazioni SDN-1 e SDN-2 non comportino rischi aggiuntivi rispetto ai processi di allevamento convenzionali basati sul fatto che non rimangono (o non sono stati inseriti nuovi geni) nel genoma. Le irregolarità genomiche, causate dal processo di modifica del genoma, hanno potenziali implicazioni per la sicurezza degli alimenti, dei mangimi e dell'ambiente.
Gli effetti indesiderati segnalati, inclusi gli effetti fuori bersaglio e gli effetti sul bersaglio, nella letteratura pubblicata suggeriscono che è necessaria una solida valutazione del rischio per gli organismi geneticamente modificati per identificare le alterazioni indesiderate derivanti dall'applicazione dell'editing genomico e come queste si riferiscono al cibo, mangimi e sicurezza ambientale. Riteniamo pertanto, in linea con altri [13, 111], che non solo sia necessaria la valutazione del rischio, ma che sia anche necessario estendere la valutazione del rischio GM dell'Unione Europea per garantire che i nuovi tipi di irregolarità genomiche e i pericoli associati siano previsti all'interno del processo di valutazione del rischio.
Linee guida per la valutazione del rischio relativo ai prodotti tecnologici di ingegneria genetica di prima generazione sono state sviluppate dall'EFSA per l'ambiente [21, 22], per alimenti e mangimi [23, 24]. A seconda della specifica applicazione di modifica del genoma, molte delle preoccupazioni associate agli OGM di prima generazione si applicano anche agli organismi sviluppati attraverso nuove tecniche di ingegneria genetica. Tuttavia, le tecniche di modifica del genoma possono causare in molti casi ulteriori irregolarità genomiche non intenzionali, il che implica che le attuali linee guida e gran parte dell'esperienza acquisita dalla valutazione del rischio degli OGM di prima generazione non possono essere estrapolate direttamente alla valutazione del rischio degli organismi geneticamente modificati. Pertanto, le linee guida per la valutazione del rischio, sia per l'ambiente che per gli alimenti/mangimi, richiederanno una revisione e un'espansione per garantire che tengano conto di tutti i pericoli associati agli organismi geneticamente modificati [111]. Le linee guida per la valutazione del rischio dovranno inoltre essere sottoposte a revisioni, e revisioni periodiche, man mano che le tecniche di modifica del genoma e le loro nuove applicazioni (ad esempio modifica della base, modifica primaria, modifica dell'RNA, modifica dell'epigenoma) si sviluppano e man mano che si acquisisce la conoscenza dei rischi (ad esempio di effetti indesiderati).
In generale, la procedura di valutazione del rischio non riesce a identificare e quantificare tutti i rischi per l'ambiente, gli animali e l'uomo a causa della conoscenza incompleta degli effetti sull'organismo della modificazione genetica (intenzionale o non intenzionale), dell'ambiente ricevente (ad esempio l'ecologia dell'ambiente agricolo) e le interazioni tra l'OGM e l'ambiente ricevente. Inoltre, l'approccio dell'EFSA alla valutazione del rischio è stato criticato come riduzionista in termini di comprensione concettuale della biologia, della genetica e dell'ecologia, principalmente a causa del presupposto che ogni cambiamento genetico agisce indipendentemente da tutti gli altri geni e cambiamenti [185]. È evidente che la metodologia scientifica utilizzata nella valutazione del rischio richiederà un'ulteriore considerazione e il ruolo del principio di precauzione sarà rafforzato. Tutti gli OGM, compresi gli OGM modificati dal genoma, possono avere effetti negativi sull'ambiente e sulla sicurezza di alimenti e mangimi, ma i dati sono limitati e l'incertezza scientifica rimane elevata.
Esistono due grandi categorie di pericoli relativi alla valutazione del rischio degli OGM. Questi sono:
1) Quelli relativi al processo di ingegneria genetica;
2) Quelli relativi alla nuova caratteristica.
Entrambe le categorie richiedono elementi aggiuntivi da considerare per includere i pericoli specificamente associati agli organismi geneticamente modificati.
Valutazione del rischio relativo al processo di modifica del genoma
Tutte le applicazioni di modifica del genoma, SDN-1, SDN-2 e SDN-3, possono portare a irregolarità genomiche a livello molecolare, comprese alterazioni nei siti fuori bersaglio e nel/intorno al sito bersaglio [76, 93, 125, 127]. Potrebbero ancora essere scoperti altri modi in cui potrebbero verificarsi effetti indesiderati. Le conseguenze degli effetti indesiderati per la valutazione del rischio non possono essere valutate in senso generale in quanto è probabile che dipendano fortemente dall'effetto indesiderato stesso. Analogamente alle irregolarità genomiche negli OGM prodotti dalle tecnologie di ingegneria genetica di prima generazione, gli effetti indesiderati nelle colture geneticamente modificate potrebbero portare a una varietà di effetti inaspettati. Ad esempio, il funzionamento di un particolare gene (non bersaglio) può essere compromesso se un componente del DNA viene scisso dalla nucleasi. Ciò porterebbe a cambiamenti nella biochimica degli organismi, compreso il suo profilo metabolico e proteico che, a sua volta, potrebbe influire sulla sua tossicità e allergenicità. Poiché ciò potrebbe avere un impatto sulla sicurezza degli alimenti, dei mangimi e dell'ambiente, qualsiasi organismo geneticamente modificato dovrebbe essere sottoposto a screening dell'intero genoma per rilevare eventuali irregolarità genetiche. Tali effetti rilevati dovrebbero essere valutati per le loro potenziali conseguenze prima di qualsiasi rilascio deliberato nell'ambiente (comprese le prove sul campo) e l'immissione sul mercato come alimenti o mangimi.
Per ciascun organismo geneticamente modificato, i rischi dovranno essere valutati individualmente, riscontrando le irregolarità genomiche che interessano entrambi i siti fuori bersaglio, le alterazioni in/attorno al sito bersaglio previsto e le conseguenze indesiderate, comprese quelle della multifunzionalità genetica. La segnalazione di effetti sul bersaglio lontani dal sito di destinazione indica la necessità di estendere la definizione di effetti fuori bersaglio oltre quelli creati dall'errore di riconoscimento del gRNA. Gli effetti fuori bersaglio possono non solo produrre alterazioni particolarmente piccole e non intenzionali della sequenza nucleotidica che si verifica, ma possono anche includere grandi riarrangiamenti e delezioni. Dovranno essere presi in considerazione anche gli effetti indesiderati derivanti dall'applicazione della tecnologia di ingegneria genetica di prima generazione (ad esempio l'inserimento di DNA ricombinante) per introdurre i componenti CRISPR/Cas. È necessario ricercare irregolarità sia nel genoma che nell'epigenoma di un OGM di prima generazione e di OGM geneticamente modificati che impiegano tecniche di ingegneria genetica di prima generazione. Tuttavia, finora l'EFSA non richiede di presentare dati sulle alterazioni epigenetiche per gli OGM.
Sebbene secondo la direttiva UE 2001/18/CE e il regolamento (CE) n. 1829/2003 siano necessarie informazioni sugli effetti previsti e non intenzionali risultanti dalle modificazioni genetiche, i requisiti per i dati molecolari sono focalizzati sull'inserto del DNA e regioni contigue, pertinenti agli OGM di prima generazione. Potrebbe essere necessario rivedere questi requisiti per garantire che i dati sul DNA non siano limitati a una particolare regione del genoma, ma siano invece a livello di genoma; ad es. una richiesta obbligatoria per il sequenziamento dei dati sull'intero genoma. Tuttora, la maggioranza degli studi sulla modifica del genoma, alla ricerca di effetti fuori bersaglio, ha utilizzato approcci in silico distorti per studiare il genoma nei siti previsti [93]. Tuttavia, questi approcci potrebbero non rilevare irregolarità genomiche, inclusi inserimenti non intenzionali e riarrangiamenti genomici, che potrebbero essere meglio identificati applicando protocolli standardizzati, ad es. sequenziamento dell'intero genoma combinato con una robusta analisi bioinformatica. Tuttavia, alcune variazioni genetiche identificate dal sequenziamento dell'intero genoma potrebbero non essere assegnate in modo univoco ad alterazioni non intenzionali o variazioni naturali. Sono necessarie ulteriori ricerche per decidere sul protocollo per un'indagine adeguata e imparziale degli effetti fuori bersaglio e di altre irregolarità genomiche.
In particolare per gli OGM geneticamente modificati, è già evidente che irregolarità involontarie possono verificarsi a diversi livelli, non solo a livello genomico, ma anche a livello epigenetico e trascrittomico. Pertanto, una valutazione del rischio richiede informazioni, non solo dell'intero genoma ed epigenoma, ma anche del trascrittoma, del proteoma e del metaboloma per valutare le conseguenze degli effetti indesiderati. Tuttavia, attualmente non sono richiesti dati sull'epigenoma né sul trascrittoma nella valutazione del rischio degli OGM. Diverse tecniche disponibili potrebbero aiutare la valutazione dei rischi degli OGM geneticamente modificati e anche migliorare l'attuale valutazione del rischio degli OGM creati da tecnologie di ingegneria genetica di prima generazione. Questi sono collettivamente riassunti come approcci «omici» e includono analisi del DNA (genomica), del profilo dell'RNA (trascrittomica), delle proteine (proteomica) e dei metaboliti (metabolomica) [193,194,195]. Queste tecniche sono o potrebbero essere ulteriormente sviluppate per affinare le loro capacità di essere utilizzate per analizzare gli OGM [196,197,198] e, nel prossimo futuro, l'invio di dati da queste tecniche potrebbe essere un requisito a sostegno di un'applicazione per commercializzare tutti gli organismi geneticamente modificati. Ulteriori sviluppi e miglioramenti dei metodi di metabolomica sono potenzialmente utili per favorire la tracciabilità e l'etichettatura degli organismi geneticamente modificati [191].
Le piante condividono il loro habitat con una varietà di microbi che includono batteri, funghi, oomiceti e virus [199,200,201]. La composizione del microbiota di una pianta dipende da complesse interazioni multilaterali tra l'ambiente abiotico e i suoi abitanti biotici [201]. La rizosfera, ad esempio, è una parte del suolo influenzata dalle secrezioni delle radici di una pianta e può contenere più di 30.000 specie procariotiche [202]. Il genoma di tutti i microbi (microbioma) è considerato il secondo genoma di una pianta in quanto è molto più grande di quello della pianta. I microbiomi sono importanti per l'assorbimento di nutrienti come il fosforo e l'azoto delle piante. In cambio, il microbioma riceve carbonio negli essudati radicali [201]. Tra gli altri, il microbioma modula anche l'immunità di una pianta e ne previene la colonizzazione da parte di agenti patogeni [203]. Pertanto, il microbioma svolge un ruolo importante per i tratti funzionali di una pianta come la resa del raccolto e la qualità dei nutrienti [204]. Le piante geneticamente modificate dovrebbero anche essere analizzate per quanto riguarda la composizione del loro microbioma utilizzando, ad esempio, approcci di metabolomica [205]. Sono necessari studi completi che indaghino sulle dinamiche della comunità, poiché le singole specie microbiche regolano la struttura e la stabilità della comunità [205]. Sono necessarie ulteriori ricerche per indagare ulteriormente l'interazione ospite-microbioma e definire i sistemi ospite-microbioma per le piante coltivate con raccolte di colture microbiche standardizzate e genomi di riferimento [206].
Il parere dell'EFSA sull'SDN-3 del 2012 [26] ritiene che l'editing genomico possa «ridurre al minimo i pericoli» e che i cambiamenti fuori bersaglio sarebbero «minori di quelli che si verificano con la maggior parte delle tecniche di mutagenesi» e sarebbero «dello stesso tipo di quelli prodotti dalle convenzionali tecniche di allevamento». Tuttavia, come descritto sopra, un gran numero di pubblicazioni dal 2012 dimostra che diversi tipi di irregolarità genomiche possono spesso essere generati utilizzando applicazioni SDN-1, SDN-2 e SDN-3. Molte di queste irregolarità sono specifiche dell'editing genomico e sostanzialmente diverse da quelle prodotte dall'allevamento convenzionale. Le tecniche di modifica del genoma sono fondamentalmente diverse dalla mutagenesi tradizionale, ne consegue che gli errori indotti non sono direttamente confrontabili. Pertanto, questa dichiarazione dell'EFSA ha poche o nessuna base scientifica e il confronto con l'allevamento convenzionale e la mutagenesi tradizionale richiede una rivisitazione e revisione alla luce delle nuove pubblicazioni. Le irregolarità genomiche generate dall'editing genomico potrebbero avere conseguenze di vasta portata, possibilmente con conseguenze importanti per la sicurezza ambientale, degli alimenti e dei mangimi. Oltre alle irregolarità genomiche, le applicazioni SDN-1 e SDN-2 hanno anche il potenziale per generare cambiamenti del genoma che finora non erano possibili, creando caratteristiche biologiche che fino ad ora non erano state raggiunte dall'ibridazione convenzionale. Pertanto, i rischi di un organismo geneticamente modificato devono essere completamente studiati per ulteriori conclusioni sulla sua sicurezza.
Valutazione del rischio relativo alla nuova caratteristica
La valutazione del rischio per le piante geneticamente modificate dovrà considerare uno spettro più ampio di nuove combinazioni genetiche e nuove caratteristiche rispetto alle poche caratteristiche introdotte dalla tecnologia di ingegneria genetica di prima generazione (prevalentemente, resistenza agli erbicidi e agli insetticidi e loro combinazioni) [13, 111, 151]. Per gli animali da allevamento geneticamente modificati, la maggior parte delle caratteristiche e delle combinazioni genetiche saranno nuove poiché, ad oggi, non sono state presentate domande per la commercializzazione di animali da allevamento geneticamente modificati per uso alimentare nell'UE, e le linee guida esistenti dell'EFSA per la valutazione del rischio per gli animali si concentrano principalmente su insetti e pesci [22, 24]. È probabile che l'ampio spettro delle nuove caratteristiche fornisca nuovi e potenzialmente complessi problemi per la valutazione del rischio. Caratteristiche come l'alterazione della nutrizione possono introdurre una variante in un ecosistema (agricolo) in cui quel composto non esiste normalmente o naturalmente. Ad esempio, è stato scoperto che una camelina GM (di prima generazione) che produce acidi grassi a catena lunga che sono nuovi per l'ambiente terrestre [207] esercita effetti tossici su alcuni lepidotteri [208] che potrebbero influenzare negativamente la rete trofica.
La valutazione del rischio relativa alla caratteristica di un organismo geneticamente modificato è, in una certa misura, simile a quella esistente per gli OGM sviluppati utilizzando tecniche di ingegneria genetica di prima generazione [21, 23, 24]. Vale a dire, la sua caratteristica dovrà essere valutata ai fini della sicurezza ambientale (ad esempio, tra l'altro, tossicità per organismi non bersaglio, potenziali modifiche all'invasività) e per la sicurezza umana e animale (ad esempio, tra l'altro, allergenicità). Gli OGM di prima generazione sono costituiti prevalentemente da colture resistenti agli erbicidi e agli insetti, ed è qui che risiede l'esperienza dell'UE nella valutazione delle caratteristiche degli OGM. Al contrario, le caratteristiche che possono, almeno teoricamente, essere conferite dall'editing genomico sono molto varie e le possibilità di alterare il genoma attraverso nuove combinazioni genetiche sono più numerose [13, 111, 151, 160]. Abbiamo mostrato (Tabella 1) alcuni esempi di colture contenenti nuove caratteristiche, che erano naturalmente presenti nelle piante e modificate dalle applicazioni SDN-1 (ad es. grano modificato da CRISPR/Cas per avere un contenuto di glutine inferiore [168]). Queste caratteristiche alterate pongono sfide per la valutazione del rischio in quanto possono avere un impatto sulle interazioni delle piante con l'ambiente biotico. Pertanto, è necessario che gli studi valutino i potenziali impatti di caratteri diversi dalla tolleranza agli erbicidi e dalla resistenza agli insetti. Inoltre, l'impatto dei cambiamenti (multipli) previsti del genoma richiede una valutazione in merito alla loro potenziale interferenza nelle vie di segnalazione e metaboliche. In alcuni casi, sarà difficile o addirittura impossibile identificare adeguati comparatori non GM, un problema riscontrato anche con colture GM potenziate dal punto di vista nutrizionale sviluppate attraverso tecniche GM di prima generazione.
Eckerstorfer et al. hanno esaminato le nuove caratteristiche delle piante geneticamente modificate sviluppate da nuove tecniche di ingegneria genetica [13]. Suggeriscono di raggrupparle in tre classi per la valutazione del rischio: (1) quelle relative alle caratteristiche delle piante allevate convenzionalmente; (2) quelle stabilite con caratteristiche simili a piante geneticamente modificate di prima generazione e (3) quelle che non sono state stabilite né con metodi convenzionali né con altri metodi biotecnologici. La conoscenza precedente può essere insufficiente e le informazioni disponibili limitate per molte di queste caratteristiche. Gli autori hanno suggerito che, per ogni caratteristica, è importante considerare non solo la modifica stessa, ma anche l'impatto della modifica e della nuova caratteristica sulla fisiologia e fenologia della pianta GM [13]. Inoltre, sottolineano l'importanza di considerare le caratteristiche specifiche dell'approccio tecnico e le conoscenze esistenti sul potenziale di modifiche indesiderate/attività fuori obiettivo. Ciò suggerisce che, sebbene sia importante rilevare e valutare gli effetti inattesi a livello di organismo, potrebbe anche essere importante attribuire questi cambiamenti a irregolarità genomiche non intenzionali o conseguenze della nuova caratteristica.
Estendere la valutazione del rischio
Attualmente, ci sono solo poche pubblicazioni che discutono in dettaglio la valutazione del rischio degli organismi geneticamente modificati [13, 111, 182]. Ciò è notevole considerando il numero crescente di pubblicazioni, come qui recensito, che descrivono il potenziale per la creazione di errori genetici durante il processo di modifica del genoma. Come abbiamo qui mostrato, ci sono rischi specifici associati all'editing genomico che potrebbero avere un impatto su alimenti/mangimi e sulla sicurezza ambientale. Pertanto, l'attuale valutazione del rischio degli OGM da parte dell'UE richiederà un’estensione per comprendere le ulteriori sfide poste dalle piante e dagli animali geneticamente modificati. Questa estensione della valutazione del rischio sarebbe notevolmente facilitato da un programma di ricerca indipendente ben finanziato per esaminare in modo completo la gamma di potenziali errori genetici creati dai processi di modifica del genoma e convalidare (o altrimenti rifiutare) qualsiasi ipotesi e premessa riguardante i potenziali rischi di organismo geneticamente modificato per l'ambiente e la salute umana e animale.
I rischi specifici associati al processo di editing genomico e i rischi associati alla nuova caratteristica generata utilizzando l'editing genomico, nonché i rischi associati all'uso di vecchie tecniche di ingegneria genetica nell'editing genomico sono riassunti in Fig. 1. Gli altri tipi di irregolarità genomiche non intenzionali richiedono che l'attuale esame del DNA venga approfondito per comprendere l'esame dei cambiamenti epigenetici e dei cambiamenti nel trascrittoma, nel proteoma e nel metaboloma dell'OGM (Fig. 1d). Tali esami richiederanno un ulteriore sviluppo del WGS e degli approcci «omici» [191] e potrebbero essere supportati da nuovi strumenti analitici in futuro. Tali strumenti possono anche facilitare il rilevamento e l'identificazione di colture e animali geneticamente modificati, che a loro volta potrebbero aiutare nella tracciabilità e nell'etichettatura degli OGM per consentire la scelta del consumatore [209] e la protezione dei sistemi agricoli che escludono gli OGM, ad es. agricoltura biologica [210]. Per la tracciabilità, la documentazione chiave richiesta sono i dati molecolari sulle sequenze di DNA alterate (sia le modifiche intenzionali che non intenzionali) apportate durante il processo di modifica del genoma. Come per gli OGM di prima generazione, questi dati aiuterebbero il monitoraggio indipendente della presenza/assenza di questi OGM, ad es. negli alimenti [163]. Inoltre, qualora dovessero emergere effetti indesiderati, la documentazione di sequenze genomiche alterate consentirà di rintracciare l'originatore, facilitando il richiamo, se possibile.
Fig. 1
Fonte: Broadening the GMO risk assessment in the EU for genome editing technologies in agriculture
Elementi di una valutazione del rischio per gli organismi geneticamente modificati. La valutazione del rischio di organismi geneticamente modificati richiede la considerazione dei rischi associati a (a) il processo di modifica del genoma che causa cambiamenti involontari del genoma, dell'epigenoma, del trascrittoma, del metaboloma e del microbioma, (b) l'uso di tecniche di ingegneria genetica di prima generazione che causano cambiamenti non intenzionali effetti come riarrangiamenti del genoma o cambiamenti epigenetici, e (c) la caratteristica che porta a effetti indesiderati a livello molecolare, cellulare, dell'organismo e dell'ecosistema. Per una solida valutazione del rischio sono necessari protocolli standardizzati (d) nonché l'implementazione di studi completi «omici» per il rilevamento e la previsione di modifiche indesiderate.
Mentre strumenti adeguati per il rilevamento di organismi geneticamente modificati possono attualmente essere considerati difficili da sviluppare o implementare [211], è da notare che solo di recente sono stati sviluppati e applicati i metodi per rilevare il verificarsi di irregolarità genomiche in corrispondenza o in prossimità del sito target durante il processo di modifica del genoma. [94, 125, 212]. La valutazione del rischio relativa ai tratti richiederà una conoscenza aggiuntiva delle loro conseguenze per l'organismo e degli impatti in caso di rilascio nell'ambiente, che sarebbe aiutata da ulteriori ricerche. Ciò può essere particolarmente necessario per i tratti in cui manca l'esperienza con le attuali piante geneticamente modificate o con le piante convenzionali a cui mancano comparatori adeguati. Inoltre, le irregolarità genomiche possono essere importanti in termini di interazioni gene x ambiente e potrebbero essere combinatorie e/o cumulative. Questo aspetto potrebbe amplificare le incertezze e le incognite riguardo alla valutazione del rischio ambientale degli organismi geneticamente modificati [213].
C'è una totale mancanza di esperienza nella valutazione del rischio relativo a eventuali caratteristiche negli animali da allevamento geneticamente modificati, in quanto non sono ancora state presentate richieste per la commercializzazione di animali geneticamente modificati nell'UE, sviluppati mediante tecniche di modifica del genoma o di prima generazione. Anche questo potrebbe richiedere ulteriori ricerche. A differenza della caratterizzazione molecolare, la valutazione del rischio correlato alla caratteristica GM può richiedere una valutazione man mano che vengono presentate richieste [di commercializzazione] aventi nuove caratteristiche.
È importante che la Commissione europea stabilisca standard adeguati per la valutazione del rischio di organismi geneticamente modificati, stabilendo un solido quadro per l'EFSA [214, 215]. La Commissione europea ha adottato il regolamento (CE) n. 503/2013 che stabilisce gli standard per la valutazione della sicurezza di alimenti e mangimi. Un regolamento di attuazione simile, utilizzando la direttiva UE 2001/18/CE come base giuridica, potrebbe stabilire gli standard per la valutazione del rischio di piante e animali geneticamente modificati senza modificare il regolamento UE sugli OGM. Tale regolamento di attuazione richiederebbe all'EFSA di considerare i rischi specifici associati all'editing genomico (come indicato nella figura 1). Il monitoraggio degli OGM dopo l'immissione sul mercato è una parte obbligatoria della gestione del rischio nell'UE, sia come sorveglianza generale per l'individuazione di effetti avversi imprevisti, sia come monitoraggio specifico caso per caso per rilevare gli effetti diretti e indiretti che sono stati individuati nella valutazione del rischio ambientale [14]. Secondo la decisione 2002/811/CE del Consiglio, il monitoraggio non dovrebbe essere considerato come ricerca in sé, ma come un mezzo per valutare o verificare i risultati e le ipotesi derivanti da ricerche precedenti e valutazione del rischio potenziale e della ricerca [216]. Pertanto, il monitoraggio post-commercializzazione può essere utilizzato per rilevare eventuali rischi nuovi, o non ancora identificati, associati sia ad ogni singolo OGM geneticamente modificato, sia più in generale, come risultato del processo di modifica del genoma, ma il monitoraggio non può essere considerato come un sostituto della valutazione del rischio.
Vi è una crescente consapevolezza del fatto che la valutazione del rischio su base scientifica per gli OGM, compresi gli organismi geneticamente modificati, ha una portata limitata e che l'uso (o il non uso) degli OGM in agricoltura dipende anche dai valori della società. Le proposte per estendere il campo di applicazione della regolamentazione e della governance degli OGM al di là della valutazione del rischio su base scientifica includono il riconoscimento dei valori e dei presupposti sottostanti che danno forma alla scienza e all'innovazione, il rispetto dei valori etici, sociali e culturali, la garanzia della sostenibilità dei sistemi agricoli e la considerazione di una gamma di alternative agli alimenti derivati da OGM [217, 218]. La complessità delle questioni in questa governance allargata può beneficiare del coinvolgimento di un'ampia gamma di persone provenienti da diversi settori della società [217].
Una significativa preoccupazione sociale circonda gli OGM, compresi gli animali geneticamente modificati, in particolare gli animali da allevamento poiché sono senzienti [85, 179, 219]. Considerazioni sul benessere degli animali geneticamente modificati sono incluse nelle linee guida dell'EFSA [24]. Tuttavia, ciò che costituisce un “maggiore” benessere per gli animali GM è mal definito in quanto una caratteristica volta a migliorare il benessere degli animali può, in pratica, facilitare in primo luogo una loro cattiva gestione. Ad esempio, la resistenza alle malattie consente ai suini di essere tenuti in recinti meno igienici o più affollati [179]. Le questioni relative al benessere degli animali evidenziano la necessità di una governance allargata poiché le preoccupazioni della società possono essere fondamentali in termini di accettazione da parte dei consumatori di prodotti derivati da animali GM [85, 219].
Conclusioni
Abbiamo dimostrato qui che l'editing genomico può causare irregolarità genomiche negli OGM risultanti, anche se i geni non sono inseriti o inseriti solo transitoriamente. Mentre i requisiti di caratterizzazione molecolare nelle attuali linee guida dell'UE per la valutazione del rischio per gli OGM possono cogliere molte di queste irregolarità, alcune possono essere specifiche per l'editing genomico, ad es. integrazione involontaria di componenti plasmidici o grandi delezioni in posizioni genomiche distanti dal lato bersaglio ed eludere il rilevamento secondo le linee guida attuali.
Pertanto, l'attuale orientamento dell'UE sulla valutazione del rischio per gli OGM richiede una revisione e un'estensione a questi casi. È necessario estendere l'elemento di caratterizzazione molecolare della valutazione del rischio che consente l'analisi di effetti fuori bersaglio, effetti non intenzionali sul bersaglio ed effetti sulla regolazione genomica. Il rilevamento di eventuali effetti a valle e irregolarità genomiche richiederà lo sviluppo e la standardizzazione delle “tecnologie omiche”. Le applicazioni di tali tecnologie migliorerebbero anche la valutazione del rischio degli OGM di prima generazione. La valutazione dell'Unione Europea del rischio per gli organismi geneticamente modificati richiederà inoltre di prendere in considerazione una gamma più ampia di caratteristiche delle colture rispetto agli OGM di prima generazione. Per alcune tipologie di colture e animali geneticamente modificati potrebbe esserci una completa mancanza di esperienza nella valutazione dei rischi per l'ambiente, gli alimenti e i mangimi per animali. Sono necessari ulteriori sviluppi nelle tecnologie per monitorare il rilevamento degli effetti fuori bersaglio e degli effetti involontari sul bersaglio causati dall'editing genomico; così come sono necessari nuovi sviluppi nelle tecnologie per rilevare gli OGM conseguenti. Tuttavia, i problemi tecnologici non sono insormontabili e le tecniche possono essere sviluppate se c'è la volontà politica di farlo.
Abbreviazioni
ABE: Adenine base editors
ADAR2: Adenosine deaminases that act on ribonucleic acid 2
ANPEP: Amino peptidase N
APHIS: Animal and Plant Health Inspection Service
Bt: Bacillus thuringiensis
Cas9: Clustered regularly interspaced palindromic repeats-associated 9
CBE: Cytosine base editor
Cpf1: Clustered regularly interspaced palindromic repeats-associated endonuclease in Prevotella and Francisella 1
CRISPR/Cas: Clustered regularly interspaced palindromic repeats/Clustered regularly interspaced palindromic repeats-associated
crRNA: Clustered regularly interspaced palindromic repeats ribonucleic acid
dCas9: Dead Clustered regularly interspaced palindromic repeats-associated 9
dCas13: Dead Clustered regularly interspaced palindromic repeats-associated 13
DNA: Deoxyribonucleic acid
DSB: Double strand break
EFSA: European food safety authority
EU: European Union
FAD2: Fatty acid desaturase-2
FGF-5: Fibroblast growth factor-5
GM: Genetically modified
GMO: Genetically modified organism
Gb: Giga base pairs
gRNA: Guide ribonucleic acid
HDR: Homology-directed repair
LwaCas13a: Clustered regularly interspaced palindromic repeats-associated 13a from Leptotrichia wadei
Mbp: Mega base pairs
mRNA: Messenger ribonucleic acid
MSTN: Myostatin
NHEJ: Non-homologous end joining
ODM: Oligonucleotide-directed mutagenesis
OTE: Off-target effect
OV: Ovalbumin
OVM: Ovomucoid
PAM: Protospacer adjacent motif
PCR: Polymerase chain reaction
pegRNA: Prime editing ribonucleic acid
RNA: Ribonucleic acid
PRRSV: Porcine reproductive and respiratory syndrome virus
RNP: Ribonucleoprotein
SDN-1: Site-directed nuclease-1
SDN-2: Site-directed nuclease-2
SDN-3: Site-directed nuclease-3
shRNA: Small hairpin ribonucleic acid
TALEN: Transcription activator-like effector nuclease
T-DNA: Transfer deoxyribonucleic acid
TGEV: Transmissible gastroenteritis virus
USDA: United States Department of Agriculture
ZNF: Zinc finger nuclease
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Katharina Kawall, Janet Cotter & Christoph Then
Traduzione di Alessandro Cocuzza - Redazione di Antropocene.org
Fonte: SpringerOpen «Environmental Sciences Europe» vol. 32, Articolo N. 106 (2020)
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